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稳定株的研究细胞库(RCB)构建

稳定株的研究细胞库(RCB)构建

       符合药监法规的、满足工业生产用的CHO细胞稳定株的抗体药物表达产量，可以达到50-100p/c/d，相当于体内专职分泌细胞的水平。获得如此高产的CHO细胞稳定株，通常是通过‘选择宿主细胞’、‘优化抗体基因表达质粒’、‘优化宿主细胞稳定株的筛选和扩增方法’以及‘用基因工程修饰宿主细胞’等多个方面，并获得这些方面的正向协同效应来达到的。过去10多年的蛋白组学和转录组学的研究表明，高产细胞株的形成涉及细胞内许多通路的改变，不是几个主要节点的大变化，更可能是大量基因表达水平的微小变化；没有任何一种重要调控因素能使这些宿主细胞变成高产细胞株。

      获得‘满足工业生产用的抗体表达的宿主细胞稳定株’的基础，是早期拿到优质的RCB。获得抗体药物高产的细胞稳定株的基本步骤如下图：

细胞稳定株和药监法规要求

细胞稳定株和药监法规要求：

      构建生产用的细胞株系，是重组抗体药物的大规模生产制备的第一步。目前国际上常见的生产重组抗体的工程细胞系是哺乳动物细胞，主要包括CHO、HEK293、NS0和SP2/0细胞。这些工程细胞系需要具备以下特性：生长特性良好，无血清悬浮培养密度高（1～2×10^7cells/ml）；异源蛋白表达能力强（20～70 p/c/d），具备正确的翻译后修饰能力；宿主及重组细胞系的遗传背景清晰、表型稳定，符合ICH法规要求。

针对抗体效应机制进行抗体定制设计和开发

       单克隆抗体（mAbs）的功能与其结构密切相关。抗体结合区域（antigen-binding fragment, Fab）能够特异地识别肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA），从而调控TAA相关的下游信号通路[2]。可结晶区域（crystalline fragment, Fc）能够和表达在各类免疫白细胞上的Fcγ受体（Fcγ receptors，FcγR） 结合，从而招募和激活这类细胞，引发抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC）和抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP），清除目标肿瘤细胞。Fc也能够结合血清补体分子（C1q），继而形成膜攻击复合物（MAC）清除目的细胞，即补体依赖的细胞毒性（CDC）。此外，Fc还能够以pH依赖的方式结合新生的Fc受体（FcγRn），避免抗体被细胞降解，从而延长单抗的半衰期[1-3]。

基于CHO细胞糖基结构改造的人源抗体开发技术

       随着越来越多的治疗性抗体在CHO细胞中的大规模量产，工程细胞株本身的特性对抗体活性的影响日益得到业界的重视。尽管CHO细胞的糖基化与人类细胞的糖基化非常接近，但仍然有一些关键的不同之处。例如，CHO细胞表达的抗体带有大量的G0F糖型结构，少量的G1F和G2F结构，而糖链末端的唾液酸则几乎可忽略不计。另外，有1-20%的CHO细胞来源的抗体分子带有高甘露糖（High Mannose），而人源的抗体则仅有非常痕量（<0.1%）的高甘露糖[1]。糖链末端未被唾液酸封闭的半乳糖（Galactose）和高甘露糖对抗体的体内分布和动力学影响很大。没有唾液酸化的抗体会被肝脏中的Asialoglycoprotein Receptor （ASGPR）结合并从血液中清除。带有高甘露糖的抗体也会被肝脏中的甘露糖受体（Mannose Receptor， ManR）结合并迅速清除。运用糖基合成途径改造过的CHO细胞株，包括岩藻糖缺失、唾液酸化，去除岩藻糖和唾液酸化抗体改造，可以实现对抗体的糖基人源化改造。

基于CHO细胞糖基结构改造的人源抗体开发技术

       随着越来越多的治疗性抗体在CHO细胞中的大规模量产，工程细胞株本身的特性对抗体活性的影响日益得到业界的重视。尽管CHO细胞的糖基化与人类细胞的糖基化非常接近，但仍然有一些关键的不同之处。例如，CHO细胞表达的抗体带有大量的G0F糖型结构，少量的G1F和G2F结构，而糖链末端的唾液酸则几乎可忽略不计。另外，有1-20%的CHO细胞来源的抗体分子带有高甘露糖（High Mannose），而人源的抗体则仅有非常痕量（<0.1%）的高甘露糖[1]。糖链末端未被唾液酸封闭的半乳糖（Galactose）和高甘露糖对抗体的体内分布和动力学影响很大。没有唾液酸化的抗体会被肝脏中的Asialoglycoprotein Receptor （ASGPR）结合并从血液中清除。带有高甘露糖的抗体也会被肝脏中的甘露糖受体（Mannose Receptor， ManR）结合并迅速清除。运用糖基合成途径改造过的CHO细胞株，包括岩藻糖缺失、唾液酸化，去除岩藻糖和唾液酸化抗体改造，可以实现对抗体的糖基人源化改造。

针对抗体效应机制进行抗体定制设计和开发

       单克隆抗体（mAbs）的功能与其结构密切相关。抗体结合区域（antigen-binding fragment, Fab）能够特异地识别肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA），从而调控TAA相关的下游信号通路[2]。可结晶区域（crystalline fragment, Fc）能够和表达在各类免疫白细胞上的Fcγ受体（Fcγ receptors，FcγR） 结合，从而招募和激活这类细胞，引发抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC）和抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP），清除目标肿瘤细胞。Fc也能够结合血清补体分子（C1q），继而形成膜攻击复合物（MAC）清除目的细胞，即补体依赖的细胞毒性（CDC）。此外，Fc还能够以pH依赖的方式结合新生的Fc受体（FcγRn），避免抗体被细胞降解，从而延长单抗的半衰期[1-3]。

糖基结构改造型抗体

 糖基结构改造型抗体
 
       抗体作为免疫系统的组成部分，在抵御疾病中发挥重要的作用。其发挥作用的途径之一是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，是一种细胞介导的免疫防御机制，抗体和靶细胞膜表面抗原结合，然后引导效应细胞裂解靶细胞。主要的效应细胞包括：NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和γδ T细胞[1-2]。抗体在细胞内合成的过程中，会进行糖基化修饰，其中N-链岩藻糖(Fucose)的修饰，会影响其ADCC作用 [3]。不含岩藻糖的抗体，其与FcγRIIIa的亲和力会增强，进而通过相应的信号通路和细胞过程，增强了自然杀伤(NK)细胞介导的ADCC [4-5] 。 Lec13突变细胞表达的无岩藻糖修饰的人IgG与FcγRIIIa亲和力提高了50倍，ADCC作用提高了100倍[6]。

野生型抗体

      抗体(Antibody，Ab)，也被称为免疫球蛋白，是一种大型的Y型蛋白质，由免疫系统的B细胞分泌产生，用来中和病原菌和病毒等病原体，是机体的防御系统。抗体由Fab和Fc组成。抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体。单克隆抗体可通过杂交瘤技术获得的。从单克隆杂交瘤细胞中，扩增出抗体的序列，可以用于生产重组抗体。相对于多克隆抗体和杂交瘤来源的单克隆抗体，重组抗体具有以下优势：（1）抗体识别单一表位，具有更高的可重复性和特异性；（2）解决了杂交瘤本身的不稳定性对抗体表达的影响；3）可以对抗体进行序列上的改造，以满足各种各样的需求；（4）大规模生产；（5）更容易控制各批次生产之间的差异。