稳定株的研究细胞库(RCB)构建

       符合药监法规的、满足工业生产用的CHO细胞稳定株的抗体药物表达产量，可以达到50-100p/c/d，相当于体内专职分泌细胞的水平。获得如此高产的CHO细胞稳定株，通常是通过‘选择宿主细胞’、‘优化抗体基因表达质粒’、‘优化宿主细胞稳定株的筛选和扩增方法’以及‘用基因工程修饰宿主细胞’等多个方面，并获得这些方面的正向协同效应来达到的。过去10多年的蛋白组学和转录组学的研究表明，高产细胞株的形成涉及细胞内许多通路的改变，不是几个主要节点的大变化，更可能是大量基因表达水平的微小变化；没有任何一种重要调控因素能使这些宿主细胞变成高产细胞株。

      获得‘满足工业生产用的抗体表达的宿主细胞稳定株’的基础，是早期拿到优质的RCB。获得抗体药物高产的细胞稳定株的基本步骤如下图：

       用于表达生物药物的宿主细胞主要是CHO细胞、HEK293细胞和NS0细胞。全球目前用于抗体表达的最普遍的宿主细胞是CHO细胞（CHO-DG44、CHO-DXB11或CHO-K1），而CHO-K1细胞正在获得生物制药工业界的青睐。CHO细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌内源蛋白，非常适于表达医用重组蛋白产品。

      将抗体的重链和轻链基因放在同一个表达质粒上，通过启动子的优化来‘使CHO细胞内的重链蛋白和轻链蛋白的表达比例接近哺乳动物细胞的天然状态’，减少‘因某一蛋白在CHO细胞内部的过表达而造成自动启动细胞内部的蛋白降解机制’的负担，是表达质粒的优化方向。

      通过转染方法（电击法或脂质体法，电击法更为工业界所接受）将携带抗体基因的线性化质粒导入CHO细胞后，可以用质粒上的抗生素基因做为筛选压力来富集‘整合了质粒到转录活跃区的CHO细胞’。然后再通过CHO细胞上带有的隐性筛选标记（如DHFR或GS）来实现‘对整合了质粒的CHO细胞的进一步筛选’和抗体基因的扩增，以实现‘CHO细胞内的抗体基因拷贝数的增加导致了转录和翻译水平的提高’之目的，最终实现外源抗体基因的高效表达和分泌。二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）系统是哺乳动物细胞中最常用的两种基因扩增系统。

       在上述为期1～2周的基因扩增过程中，CHO细胞内的外源抗体基因的拷贝数可能会出现变化，使得抗体的表达量出现先高后低的变化，然后趋向稳定。拷贝数的降低与外源抗体基因整合到CHO细胞染色体上的位置有关，位于染色体两臂末端的抗体基因更倾向于丢失。

      为了防止‘稳定高表达抗体的CHO细胞发生不利突变’，影响抗体基因拷贝数或引起细胞生长速率的变化，需要保持一个合适的选择压力。而最初选择使用DHFR^-/- CHO-DG44 或 GS^-/- CHO-K1细胞母株来开发抗体表达稳定株，就会收到事半功倍的效果，尤其是为后面的工业化大规模生产创造了很多技术便利条件，更容易通过药监部门的审核。

      按照ICH指导原则的要求，在拿到‘抗体高产的单克隆CHO细胞稳定株’的过程中，需要提供原始可溯源的实验证据，来证明其单克隆性（monoclonality）。在未来一段时间内，以影像方式采集单克隆性的原始证据，将会变得越来越获得药监部门的偏爱。

      在获得多株‘抗体高产的单克隆CHO细胞稳定株’以后，需要做这些单克隆株的比较研究和细胞株验证（clone comparison, validation and characterization），根据细胞生长速率、细胞形态、抗体高产率、细胞株稳定性、细胞悬浮培养时的低成团性（low aggregation）、抗体的均一性（尤其是保持抗体糖基化形态的典型特征）、抗体的质量等方面的要求，来确定3～5株用于未来抗体生产和药监申报的悬浮培养稳定株。取其中最好的一株，做成RCB，以便开展后面的工艺放大和优化（process development）研究。

      在工艺开发、放大和优化过程中，确定最终生产用的CHO细胞稳定株是极为重要的一步。而这需要在前期筛选阶段去模拟后期的大规模生产条件和检测抗体产品质量，以确保筛选出最佳的克隆。如果在前期筛选阶段投入资源不足、努力不够，以至于在后期工艺开发阶段不得不更换细胞株，那么，抗体产品的相似性以及相关临床研究都需要重新验证。

      在细胞株稳定性研究中，需要对细胞做40～60次倍增范围内的生产能力和基因拷贝数的检测，同时测试：1）细胞株的抗体生产能力随时间下降的情况；2）抗体质量随时间变化的情况。

     在整个‘抗体高产的单克隆CHO细胞稳定株’的开发过程以及后面的工艺放大优化工程中，使用无血清和无动物来源的CHO细胞培养液（serum-free, protein-free and animal-component-free medium），或称为CDM (Chemically Defined Medium)，已成为大势所趋，也为后面的CMC创造诸多技术便利。